1931年“九·一八”事变后，日本帝国主义的炮火激起了东北人民抗日救亡运动的总爆发。流亡入关的东北爱国人士及广大青年及时奋起，成立了许多抗日救亡组织，进行抗日复土的斗争。当于毅夫得知日本关东军策划“九·一八”事变，占领北大营，发动对华侵略战争，蒋介石命令不抵抗，东北即将全面沦陷的消息，如雷轰顶。他决心投笔从戎，连夜奋笔疾书，发出“东北沦亡，中国万难偏安；山河破碎，匹夫岂能苟全”的豪言壮语，挺身投入到抗日救亡运动中去。
此时于毅夫正在天津，在张学铭手下当秘书。张学铭是东北名将张学良的胞弟，担任天津市市长兼公安局局长。于毅夫不满国民党政府看着东北沦陷而采取不抵抗政策，坚决拥护中国共产党的抗日救国主张。张学铭被蒋介石免去本兼各职后，于毅夫也愤然辞职，再次迁居北平。1936年7月，于毅夫经中共北方局刘少奇、彭真等批准，在北平加入中国共产党。
1936年11月，沈钧儒、邹韬奋、史良、沙千里、李公朴、章乃器、王造时7位爱国领袖被南京国民党政府悍然逮捕，全国各界开展了规模空前的组织营救工作。于毅夫熟悉东北军将领和东北各界爱国领袖人物，便与高崇民、阎宝航等一起，在东北军将领中积极开展爱国救亡活动。于毅夫亲自写信给国民党将领张学良称：“不抵抗主义就是投降主义。历史上搞投降的秦桧，如今还跪在杭州岳飞墓前，是历史的罪人，绝不能当秦桧。”信中，于毅夫敦促张学良积极响应“停止内战，一致对外”的主张，同情并支持社会各界营救沈钧儒七君子的正义行动。
1936年末发生了西安事变，全国人民要求国民党政府释放张学良，国共合作，对日抗战。西安事变之后，国内形势急剧变化，于毅夫毅然参加推动营救张学良的活动。他多方联系，日夜奔走，作了巨大的努力。由于蒋介石的反动顽固，张学良将军还是长系囹圄，但社会各界对于毅夫的备竭艰辛和活动能力，都很钦佩。
1937年初，中共中央东北局工委书记刘澜波，带着周恩来的指示来到北平，组织东北人士的抗日活动。于毅夫得知消息后，立即与刘澜波取得联系，并同高崇民等人筹备成立统一的东北救亡团体“东北救亡总会”（简称“东总”），刘澜波任总会党团书记，于毅夫任总会常务委员兼宣传部长，并任中共中央东北局“东总”党组成员。
“东总”是中国共产党领导的抗日民族统一战线的群众组织，它贯彻党的全面抗战路线，与国民党顽固派进行坚决斗争。于毅夫积极活跃在东北人士和各界救亡团体之间，为发展抗日统一战线作出很大贡献。
1937年“七七事变”发生后，全国抗战开始了，全国人心激奋，处于抗战前线的平津青年学生更是热血沸腾，党领导的各救亡团体纷纷组织慰问团、服务团去前方进行宣传鼓动。于毅夫迅速组建“东总”慰劳服务团，他亲自担任团长，冒着生命危险前往前线慰问将士，分别到北平周边的宛平、门头沟、南宛慰问。在当时各慰问团中，于毅夫率领的慰问团规模最大、人数最多，驻扎宛平城长达10天时间。
北平被日军占领后，由于华北环境日益险恶，“东总”于同年7月迁到上海。于毅夫随之来沪，进行了大量联系工作，又代表“东总”前去济南组成分会，年底去武汉继续担任“东总”领导工作，直接在中共中央华中局周恩来、董必武领导下进行活动。武汉撤退后，他率东北救亡总会迁往重庆，任中共东北救亡总会党团书记兼《反攻》半月刊总编辑，著名爱国人士沈钧儒专门为《反攻》题写了刊头。
国民党中央召开五届五中全会之后，开始在各地加紧破坏抗日救亡运动。“东总”机关刊物《反攻》半月刊遭到审查与刁难，常常不得不延期出版。对此，于毅夫积极应对，并未退缩，他利用国民党各派之间的矛盾，展开上层统战工作。周恩来曾多次指出，要坚持住这块阵地，“只要东北救亡总会的牌子、《反攻》的牌子存在，蒋介石就很难出卖东北，要以这样的团体和刊物跟蒋介石作斗争”。
在中共中央南方局和周恩来的直接领导下，于毅夫参加统战团体“宪政促进会”、“兵役实施协进会”、“中苏文化协会”的工作，他参加演讲，筹办座谈会，活动能力很强，和各方面人士都谈得来，在活动中有很大的吸引力。皖南事变后，于毅夫留在重庆工作已非常困难，根据党组织的安排，他前往香港，继续从事抗日宣传工作。
