一、细菌的玻片凝集反应试验
实验目的
学习玻片凝集试验的原理、操作与观察结果的方法。
实验原理
血清学反应的基本组成成分除抗原与相对应的抗体外，还需要加入电解质（如生理盐水）。其主要作用是消除抗原抗体结合物表面上的电荷，使它们失去同电相斥的作用而转变为互相吸引，这样才能观察到肉眼可见的凝集块。
颗粒性抗原（完整的细菌细胞或血细胞等）与相应的抗体直接在有电解质的合适条件下反应，并出现肉眼可见的凝集现象，称为直接凝集反应。用于此反应中的抗原又称凝集原，抗体则称凝集素。直接凝集反应按操作方法可分为玻片凝集试验和试管凝集试验。
玻片法通常为定性试验，用已知抗体检测未知抗原。其优点是简便、快速，适用于从病人标本（或食品）中分离数量较多的未知菌种的诊断（鉴定）或血清学分型，如鉴定肠道传染病病人标本或污染肉灌肠制品中的肠道细菌等；玻片法还用于红细胞A、B、O血型的鉴定。
鉴定分离菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，直接从培养基上刮取活菌混匀于抗血清中，如细菌与抗血清是相对应的，数分钟后，即可出现细菌凝集成块现象。
实验材料
（一）菌种（抗原）
大肠杆菌（Escherichia coli）琼脂斜面培养物。
（二）抗体
大肠杆菌免疫血清（抗体或称凝集素）。
（三）试剂
0.85%生理盐水。
（四）仪器与其他用品
载玻片、接种环、水浴锅、小滴瓶等。
实验流程
稀释抗体→将抗体和生理盐水分别滴于载玻片→加抗原混匀→静置→观察凝集现象
实验步骤
（一）稀释抗体
用生理盐水稀释大肠杆菌免疫血清，稀释度为1：10，装于小滴瓶中备用。
（二）加稀释的抗体和生理盐水
在洁净载玻片的一端用滴瓶中的小滴管加1滴1：10大肠杆菌免疫血清，另一端加1滴生理盐水，两端分别做好标记。
（三）加抗原
用接种环以无菌操作自大肠杆菌琼脂斜面上挑取少许细菌混入生理盐水内，搅匀；同法挑取少许细菌混入血清内，搅匀。
（四）观察凝集现象
将载玻片略微摆动后静置于室温中1～3min，观察一端有凝集反应出现，即有凝集块或颗粒，液体变得透明，为阳性反应。另一端为生理盐水阴性对照，仍为均匀混浊。
注意事项：操作时，注意勿使液滴干燥，妨碍观察，更应注意液滴不可过大，避免转动时带菌液体碰到手上，防止实验室感染。
实验结果与报告
思考题
（1）血清学反应为什么要有电解质存在？所做的玻片凝集的阳性反应端有无电解质？
（2）简述玻片凝集反应试验的原理、特点和用途。
（3）试验用沙门氏菌或变形杆菌代替大肠杆菌，而抗血清不变，玻片凝集反应结果如何？
二、细菌的微量滴定板凝集反应试验
实验目的
学习微量滴定板凝集试验的原理、操作与观察结果的方法。
实验原理
试管法通常为定量试验，用已知抗原测定待检血清中有无某种抗体及其相对含量（抗体效价或凝集素效价），现已发展为微量滴定板凝集法。操作时，将待检血清用生理盐水做连续的两倍稀释，然后于各孔中加入等量抗原悬液，在37℃放置一定时间后观察凝集现象。视不同凝集程度记录为4+（100%凝集）、3+（75%凝集）、2+（50%凝集）、+（25%凝集）、-（不凝集），以此判定血清中抗体的效价。试验时以发生明显凝集现象（2+）的最高血清稀释倍数（稀释度的倒数），即为该血清中凝集素（抗体）的效价（也称滴度），以表示血清中抗体的相对含量。
此法常用来测定患传染病的人或家畜血清中的抗体效价，也是诊断肠道传染病的重要方法，例如诊断伤寒、副伤寒病。人或家畜感染了病原菌，病原菌作为抗原会刺激机体产生抗体。检查血清中有无相应抗体，即可判定机体是否患了某种传染病。
实验材料
（一）菌种（抗原）
大肠杆菌（Escherichia coli）琼脂斜面培养物。
（二）抗体
大肠杆菌免疫血清。
（三）试剂
0.85%生理盐水。
（四）仪器与其他用品
微量滴定板、微量移液器（20～80μL）、微量移液器吸头、显微镜等。
实验流程
制备大肠杆菌悬液→稀释大肠杆菌免疫血清→加入大肠杆菌悬液→静置→观察凝集现象
实验步骤
（一）制备大肠杆菌悬液
用生理盐水洗下大肠杆菌斜面培养物，使每1mL菌悬液含9×108个大肠杆菌，水浴60℃，0.5h。
（二）稀释大肠杆菌免疫血清（凝集素）
首先在微量滴定板上标记1～10个孔，再用微量移液器套上吸头于第1孔中加80μL生理盐水，其余各孔加50μL。然后加20μL大肠杆菌抗血清于第1孔中。换一新的吸头，在第1孔中吸吹三次以充分混匀，再吸50μL至第2孔，以同样方法混匀，以此逐级稀释至第9孔，混匀后，弃去50μL。稀释后的血清稀释度。
（三）加入大肠杆菌悬液
每孔加大肠杆菌悬液50μL，从第10孔（对照孔）加起，逐个向前加至第1孔。而后将滴定板按水平方向摇动，以混合孔中内容物。
（四）观察凝集现象
将微量滴定板置于37℃60min，再置于20℃，18～24h或4℃冰箱过夜，观察孔底有无凝集现象。通常阴性和对照孔的细菌沉于孔底，形成边缘整齐光滑的小圆块，而阳性孔的孔底为边缘不整齐的凝集块。亦可借助体视显微镜观察。当轻轻振荡滴定板后，阴性孔的圆块分散成均匀混浊的悬液，阳性孔则是细小凝集块悬浮在透明的液体中。
实验结果与报告
（1）将微量滴定板孔底凝集现象的程度用注解符号。
（2）确定大肠杆菌免疫血清的效价（凝集素的效价或滴度）。
思考题
（1）加抗原时，为什么要从最后一孔加起？
（2）稀释血清时应注意哪些问题？
三、定量环状沉淀反应试验
实验目的
学习定量环状沉淀反应的原理、操作及结果观察的方法。
实验原理
沉淀反应是指可溶性抗原（如血清蛋白、细菌培养滤液、细菌浸出液、组织浸出液等）与相应抗体结合，在有电解质的条件下，形成肉眼可见的沉淀物。参加反应的可溶性抗原称为沉淀原，参加反应的抗体称为沉淀素。
沉淀反应原理与凝集反应原理类似。区别是沉淀反应使用的抗原是可溶性的，其单个抗原分子体积小，在单位体积溶液内所需的抗体量多，故做定量试验时常将抗原稀释，而不是抗体。
沉淀反应按操作方法可分为环状沉淀试验（分定量和定性）、絮状沉淀试验、琼脂扩散试验。
环状沉淀试验由Ascoli于1902年建立，故又称Ascoli氏反应（阿斯古里氏反应）。该反应是使抗原和抗体在沉淀管内形成交界面，室温放置一段时间，在两液交界处呈现白色环状沉淀则为阳性反应。该试验主要用已知的抗体鉴定未知的微量抗原，如鉴定炭疽杆菌的耐热多糖类抗原，用于炭疽病的诊断，尤其常用于检查皮革和肉类食品中的炭疽病原菌，法医学中鉴定血迹，肉的种类鉴定（究竟是何种动物的肉类）以及沉淀素的效价测定等。试验时以出现明显白色沉淀环的最高抗原稀释倍数（稀释度的倒数），即为该血清中沉淀素（抗体）的效价。本技术的敏感度为3～20μg/mL抗原量。环状试验中抗原、抗体溶液须澄清。
实验材料
（一）抗原
马血清、正常兔血清。
（二）抗体
兔抗马免疫血清（抗体或称沉淀素）。
（三）化学试剂
0.85%生理盐水。
（四）仪器与其他用品
沉淀小管（内径2.5～3.0mm，长30mm）、小试管、毛细吸管、吸管等。
实验流程
倍比稀释抗原→稀释的抗体与不同稀释度的抗原相反应→加抗原混匀→静置→观察环状沉淀现象
实验步骤
（一）稀释抗原（马血清）
取1：25的马血清（抗原）1mL，用倍比稀释法在小试管中按稀释成各种浓度。
（二）稀释的抗体与不同稀释度的抗原相反应
（1）将9个干燥而清洁的沉淀小管插在试管架的小孔上，使其直立。
（2）用毛细吸管分别吸取1：2的兔抗马血清（抗体）稀释液，加入沉淀管底部，每管2滴。
（3）用另一毛细吸管吸上述已经稀释好的马血清，按加入各管中。第8管加生理盐水，第9管加稀释兔血清作为对照。
（三）观察沉淀现象
于37℃或室温静置10～20min，观察两液交界面有无乳白色沉淀环，凡有白色沉淀环者为阳性，记“+”，没有沉淀环者为阴性，记“-”。找出产生白色沉淀的各管中稀释度最大的一管，其稀释度的倒数即为沉淀素的效价。
注意事项：
（1）加入经适当稀释的马血清（抗原）时，应从最高稀释度加起。加入时，注意使抗原沿管壁缓慢流下，轻轻浮于兔抗马血清（抗体）面上，使之与兔抗马血清成明显界面，切勿摇动相混。
（2）必须进行对照观察，以免出现假阳性结果。
实验结果与报告
（1）将沉淀小管中沉淀现象的程度用注解符号。
（2）确定兔抗马血清的效价（沉淀素的效价或滴度）。
思考题
（1）比较凝集反应与沉淀反应的异同。
（2）环状沉淀反应试验操作要注意哪些问题？
四、定性环状沉淀反应试验
实验目的
学习定性环状沉淀反应的原理、操作及结果观察的方法。
实验原理
在定量环状沉淀反应的原理中已叙述。
实验材料
（一）抗原
被检抗原、炭疽杆菌（Bacillus anthracis）标准抗原。
（二）抗体
炭疽沉淀素血清。
（三）试剂
0.85%生理盐水。
（四）仪器与其他用品
沉淀小管（内径2.5～3.0mm，长30mm）、毛细吸管、滴管等。
实验流程
滴加抗体→沿试管壁滴加待测抗原和对照样→直立静置→观察环状沉淀现象
实验步骤
（一）加抗体
取3支沉淀小管，用滴管分别加入炭疽沉淀素血清约0.1mL（为沉淀管的1/3处），注意勿产生气泡或沾染上部管壁。
（二）加抗原
用毛细滴管将被检抗原、炭疽标准抗原和生理盐水分别加到上述沉淀管中，沿管壁缓缓加至沉淀素血清上，达沉淀管的2/3处，使两液接触处形成整齐的界面，注意勿产生气泡和勿摇动，轻轻直立放置。
（三）结果判断
抗原加入后5～10min之内判断结果。如果沉淀管两液界面出现清晰致密的乳白色沉淀环者为阳性反应。用炭疽标准抗原及生理盐水分别作阳性和阴性对照。
实验结果与报告
判断环状沉淀反应的被检抗原是否为炭疽病原菌。
五、双向琼脂免疫扩散试验
实验目的
（1）学习双向琼脂免疫扩散试验的基本原理及操作方法。
（2）观察抗原和抗体形成沉淀线的过程。
实验原理
抗原和抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，称为免疫扩散反应。将抗原与其相应抗体放在半固体琼脂凝胶平板中的邻近孔内，使它们沿浓度梯度相互扩散，当扩散至两者相遇并且浓度比例合适时，即出现乳白色的沉淀线，称为双向琼脂免疫扩散试验。用1%离子浓度的琼脂制成凝胶后，其内部形成多孔的网状结构，可允许分子质量小于2×105u的抗原和抗体自由扩散。若抗原与抗体相对应，且两者比例合适，则形成较大的抗原抗体复合物的沉淀颗粒，即不能扩散而出现白色沉淀线。
双向免疫扩散试验不仅用于定性鉴定抗原或抗体和定量测定抗体的效价，还可用于抗原或抗体的纯度分析及分析比较两种不同来源的抗原或抗体所含成分的异同。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线，可根据沉淀线的数目分析与鉴定抗原或抗体的成分和纯度。例如，肉的成分分析及肉的种类鉴定等。
抗原抗体复合物所生成的沉淀物对形成它的抗原和抗体是不可透过的，而对于其他的抗原和抗体则是可透过的。因此，对于分别放于邻近孔的抗原和抗体能反应，有一条沉淀线生成，对于同样的抗原放在邻近的两个孔中，对应抗体放于中央孔中，则彼此将以一定角度形成融合的沉淀线，若是不同的抗原，则沉淀线相互交叉，若是部分相同，则沉淀线是部分交叉，部分融合。
沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关。抗原浓度越大，形成的沉淀线距离抗原孔越远；抗体浓度越大，形成的沉淀线距抗体孔越远。因此当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据该浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之，固定抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。
实验材料
（一）抗原
马血清或牛、羊、猪、鸡血清。
（二）抗体
兔抗马免疫血清或兔抗牛、羊、猪、鸡免疫血清。
（三）试剂
0.85%生理盐水或pH8.6硼酸缓冲液、琼脂粉、1%硫柳汞。
pH8.6硼酸缓冲液：四硼酸钠8.8g、硼酸4.65g、蒸馏水1000mL。
（四）仪器与其他用品
载玻片或平皿、打孔器、打孔图、有盖搪瓷盘、毛细滴管、小镊子（牙签或注射针头）、记号笔、纱布等。
实验流程
制板→打孔→封底→稀释抗体或抗原→加样→扩散
实验步骤
（一）制板
1.制备1%离子琼脂
称取一定量琼脂粉，按1%（冬季）或1.1%（夏季）的量加入生理盐水或pH8.6硼酸缓冲液中，水浴煮沸熔化20min，再滴加1滴1%硫柳汞溶液防腐，分装三角瓶内，置冰箱中备用。
2.制备凝胶平板或凝胶玻片
将熔化并冷却至60℃左右的1%离子琼脂倾注于平皿内，置于水平位置使其均匀分布，凝固后制成厚度为5mm的凝胶平板。或吸取3.5～4.0mL的1%离子琼脂加于载玻片上，使其均匀分布而又不流失，凝固后制成厚度为2～3mm的凝胶玻片。
（二）打孔
凝胶平板放在梅花形模板图上打孔或将凝胶玻片放在方阵形模板图上打孔，并用小镊子或注射针头挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。
（三）封底
为了防止加样后液体从孔底渗漏，使抗原和抗体直接混合，打孔后应封底。方法是：向孔内添加少量熔化的琼脂，或在酒精火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底。注意：勿将琼脂熔化过多，将小孔填死。用记号笔在琼脂板的底面将各孔编号。
（四）稀释抗体或抗原
将兔抗马免疫血清原液按倍比稀释法用生理盐水稀释为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等5个稀释度，或将马血清用生理盐水按上述方法稀释。
（五）加样
以毛细滴管吸取马血清（抗原）加入中央孔内，周围6孔或4孔依次加入对照生理盐水和5个或3个稀释度兔抗马血清（从高稀释度到低稀释度）。也可中央孔加抗体，周围孔加入对照生理盐水和5个或3个稀释度的抗原。注意各孔加样量以加满为度（液体与琼脂面相平），加量少会影响反应程度，加量多则易溢出，也影响反应结果。加样时注意缓慢加入勿产生气泡。
（六）扩散
盖上平皿盖，将平皿或玻片正置于有盖搪瓷盘（内置3～4层湿纱布）中，于37℃温箱中自由扩散24～48h后观察结果。
实验结果与报告
以生理盐水对照孔为参照，观察其余各孔周围有无沉淀线及出现的位置和条数。
思考题
（1）双向琼脂免疫扩散试验主要有哪些用途？
（2）琼脂免疫扩散试验中应注意哪些操作？
