实验目的
（1）了解乳与乳制品中芽孢总数测定的原理，并掌握其检测方法。
（2）掌握乳与乳制品中耐热芽孢菌的检测方法。
实验原理
若原料乳或辅料中含有较多的芽孢菌或耐热芽孢菌，则超高温灭菌后，相应的产品中芽孢菌或耐热芽孢菌也会残留得较多，从而使产品的坏包数增加。不同的产品，须采取不同的灭菌温度和灭菌时间，若灭菌效率未达到要求，则灭菌后的产品中残留的微生物（特别是芽孢菌或耐热芽孢菌）就较多，包装后的产品就会出现坏包。
目前，我国尚无乳与乳制品中芽孢总数测定的国家标准，只有一些大型乳品企业有相关企业标准。其依据是将待检样品经80℃、10min处理后，其中残留的微生物主要是芽孢。如把它接种到适宜的培养基（酪蛋白大豆蛋白胨琼脂培养基）中，置于（35±2）℃的恒温培养箱内培养（72±2）h，进行菌落计数，得到的数据即为待检样品中所含的芽孢总数。对于耐热芽孢是将检样经100℃、10min处理后，接种于适宜的培养基中，于（55±1）℃培养（72±2）h菌落计数。为了便于准确计数，需将待检样品做适当的稀释或浓缩处理。其报告方式为：每1mL样品所长出的菌落数即为样品中所含的芽孢总数，其单位是CFU/mL。
实验材料
（一）材料
消毒乳。
（二）培养基
酪蛋白大豆蛋白胨琼脂（培养基64）或普通营养琼脂培养基（培养基4）。
（三）试剂
0.85%无菌生理盐水。
（四）仪器及其他用品
无菌试管、温度计、水浴锅、白瓷缸（用于煮开水）、无菌平皿、无菌吸管（1mL和10mL）和恒温培养箱等。
实验流程
10mL样品→水浴→迅速冷却→10倍梯度稀释→接种培养→菌落计数
实验步骤
（一）芽孢总数的检测
1.样品准备
（1）在无菌操作条件下，将10mL室温状态下的待检样品加入一个无菌试管中，塞好棉塞。
（2）在同直径的试管中加入10mL同样室温状态下的水，并插入温度计。
（3）将上述两支试管同时放入水浴中保温，待温度计温度升至80℃时开始计时。
（4）计时达10min后，迅速将样品管取出，置于4～10℃的冷水中迅速降温至室温。
（5）按无菌操作条件对降温后的样品进行稀释，编号后记录。
一般原料检验，选取10-4～10-23个稀释度的样品稀释液。
中间产品检验，选取10-2～10-12个稀释度的样品稀释液。
问题产品检验，选取10-2～10-12个稀释度的样品稀释液。
2.培养基准备
（1）检查预先经过灭菌处理的酪蛋白大豆蛋白胨琼脂培养基是否处于正常可用状态。
（2）将无菌培养基用微波炉加热2min，或用水浴锅熔化后，在40～45℃水浴中保温待用。
3.接种培养
（1）在无菌操作条件下，在一个无菌平皿内倾入15mL酪蛋白大豆蛋白胨琼脂培养基，并暴露至接种过程结束，标记后作为环境对照样品。
（2）按样品编号在无菌平皿底部做相应标记，并记录。
（3）在无菌操作条件下，用1mL的无菌吸管移取1mL选定的样品稀释液或样品原样至无菌平皿内。
（4）同上对同一样品重复操作。即每个选定的样品稀释度做两个平皿。
（5）按以上步骤，以1mL无菌生理盐水作为空白操作对照。
（6）在无菌操作条件下，将约15mL的酪蛋白大豆蛋白胨琼脂培养基倾入样品平皿中，将平皿置于操作台面上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。
（7）待琼脂凝固后，将平皿翻转，即保持有标记和培养基的一面向上。
（8）将所有平皿（包括空白和环境对照）置于（35±2）℃的恒温培养箱内，保温培养60～62h。
（9）在保温时间。
4.菌落计数
（1）选择菌落数在30～300之间的平皿为标准，在菌落计数器上计数每个平皿上的菌落数。
（2）检验结果=平行样品菌落数之和/2×稀释倍数。
（3）计数结果在100以内，按实际计数报告；在100～10000的，按两位有效数字报告。
（二）耐热芽孢的测定
1.样品准备
（1）在无菌操作条件下，用10mL灭菌吸管吸取5mL乳样加入灭菌试管中，塞好棉塞。
（2）在同直径的试管中加入5mL同样室温状态下的水，并插入温度计。
（3）将装有乳样和水的试管同时放入沸水浴中（在电炉上用白瓷缸把水煮沸，并保持沸腾）。直至“装水试管”的温度达到100℃，计时10min（如果水不到100℃就沸腾，则等候时间延长；或在水中加入盐以提高沸点温度，但要避免乳样沸腾）。
（4）10min后，取出试管，用冷水冲，使含乳样的试管冷却。
（5）按无菌操作条件对降温后的样品稀释10倍（10-1）。
2.培养基准备
（1）检查预先经过灭菌处理的酪蛋白大豆蛋白胨琼脂培养基是否处于正常可用状态。
（2）将无菌培养基用微波炉加热2min，或用水浴锅熔化后，在40～45℃水浴中保温待用。
3.接种培养
（1）选取样液和10-1稀释度的样品计数，用1mL灭菌吸管分别吸取上述样品1mL于灭菌平皿中，每个稀释度2块平板。
（2）及时将冷却至46℃的营养琼脂注入平皿约15mL，并转动平皿使之混匀；同时将营养琼脂分别注入加有1mL灭菌生理盐水的平皿和另一个灭菌的空白平皿内，作空白对照。
（3）在无菌操作条件下，在一个无菌平皿内倾入15mL酪蛋白大豆蛋白胨琼脂培养基，并暴露至接种过程结束，标记后作为环境对照样品。
（4）待营养琼脂凝固后，翻转平板，置于（55±1）℃的培养箱内培养48～72h，取出计数。
（5）按样品编号在无菌平皿底部作相应标记，并记录。
（6）在记录保温时间。
4.菌落计数
同芽孢总数测定的计数方法。
实验结果与报告
将芽孢总数和耐热芽孢菌数测定结果。
思考题
（1）芽孢总数和耐热芽孢菌数测定应该注意哪些问题？
（2）如何在培养平板中辨别芽孢菌？
