实验目的
（1）了解质粒DNA的提取原理。
（2）以大肠杆菌和乳酸菌为例，掌握革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌质粒的提取方法。
实验原理
质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1～200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
较常用的质粒DNA提取方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（＜15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（＞15kb）。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其原理为染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子，当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性时恢复其天然构象，变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，离心去除沉淀后，就可从上清液中回收质粒DNA。
目前，市场上质粒提取试剂盒大多数都是采取上述的碱裂解方法，不同之处在于纯化方式。目前比较常用的纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。
实验材料
（一）菌种
大肠杆菌JM109、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）。
（二）培养基
LB液体培养基（培养基2）、M17液体培养基（培养基15）。
（三）试剂
现在质粒DNA提取试剂盒的品种较多，但操作大同小异，现以天根（TIANGEN）生化科技有限公司的质粒小量提取试剂盒为例来说明质粒的提取方法。
RNaseA（10mg/mL）、平衡液BL、溶液P1、溶液P2、溶液P3、漂洗液PW、洗脱缓冲液EB、吸附柱CB3、收集管（2mL）。
（四）仪器及其他用品
微量移液器、离心管、台式离心机、电泳仪、电泳槽。
实验流程
实验步骤
（一）使用前准备
（1）溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2～8℃保存。
（2）第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇（例如向15mL的漂洗液中加入60mL的无水乙醇）。
（3）使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
（4）注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。
（5）所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12000r/min（约为13400×g）。
（6）提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
（7）实验前使用平衡液处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
（8）用平衡液处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。
（二）操作步骤
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。
（2）取1～5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000r/min离心1min，尽量吸除上清液（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
如果是革兰氏阳性菌，如乳酸乳球菌，由于其细胞壁较厚，会严重阻碍细菌细胞的裂解，因此，应该加入适量的溶菌酶辅助破壁，具体处理方法可以在加入溶液P1后，充分悬浮菌体后，加入溶菌酶使其终浓度为10～20mg/mL，37℃处理30min左右。加入溶菌酶的浓度和处理时间可根据不同的菌株和具体的实验条件进行调整。
注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
（4）向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转4～6次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈振荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮黏稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。
（5）向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000r/min离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清液中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清液。
（6）小心地将上清液倒入或用移液器转移到吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。室温放置1～2min，12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（7）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（8）向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000r/min离心30～60s，弃掉收集管中的废液。
（9）将吸附柱CB3重新放回收集管中，12000r/min离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CB3开盖，置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
（10）将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100μL洗脱缓冲液EB，室温放置1min，12000r/min离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH在7.0～8.5范围内（可以用NaOH将水的pH调到此范围），pH低于7.0会降低洗脱效率。
洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
（11）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤（10）。
实验结果与报告
利用紫外凝胶成像系统观察提取质粒的纯度及浓度，并作记录。
注意事项
（1）质粒提取过程中的注意事项已在操作步骤中详细指出，请实验时注意。
（2）如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5～10mL过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液EB应在70℃预热，在吸附和洗脱时可以适当地延长时间，以增加提取效率。其他步骤相同。
思考题
（1）革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌质粒的提取方法的不同点是什么？
（2）为什么加入溶液P2后的操作时间不能超过5min？
（3）为什么残留乙醇后会影响后续的实验？
